최적의 자아

Scientific Reports 12권, 기사 번호: 9483(2022) 이 기사 인용

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RNA 및 DNA 전달을 위한 지질 나노입자(LNP)는 광범위한 질병을 치료하고 코로나 백신용 mRNA를 벡터화하는 능력으로 인해 상당한 주목을 받아 왔습니다. LNP는 생체분자와 지질을 혼합하여 생성되며, 이는 자가 조립되어 원하는 구조를 형성합니다. 이 영역에서 미세유체공학은 높은 혼합 품질, 낮은 응력 조건 및 빠른 준비라는 분명한 이점을 보여줍니다. 마이크로믹서에서 생산된 LNP에 대한 연구에서는 특정 유속 범위에서 크기, 단분산성 및 캡슐화 효율성 측면에서 성능이 저하되는 것으로 나타났습니다. 본 연구에서는 높은 처리량에 잘 적응하는 링 마이크로 믹서에 중점을 둡니다. 우리는 장치의 혼합 성능을 제어하는 병렬, 과도기 및 고도 혼합의 세 가지 방식을 공개합니다. 또한, 극저온 TEM 및 생화학적 분석을 사용하여 혼합 성능이 우리가 생산하는 LNP의 특성과 밀접한 상관관계가 있음을 보여줍니다. 우리는 유속 비율의 중요성을 강조하고 기하학적, 단분산성 및 캡슐화 수율 측면에서 최적의 특성을 가진 LNP를 생산하기 위한 시간적 불안정성의 시작을 기반으로 하는 물리적 기준을 제안합니다. 이러한 기준은 일반적으로 적용 가능합니다.

지난 10년 동안 많은 발전이 이루어졌습니다. 실제로, 세기 초 최초의 마이크로 믹서가 등장한 이후 다양한 개념을 기반으로 하는 약 100개의 기능 장치가 개발되었습니다. 이들 모두에는 장점과 단점이 있지만 전체적으로 사용자는 미세 유체 혼합기 카탈로그에서 관심 있는 응용 프로그램에 해당하는 형상을 찾는 경우가 많습니다. 최근 몇 년 동안 이러한 장치를 사용하여 LNP(지질 나노입자)를 생산한다는 아이디어가 등장했습니다4,5. LNP는 핵산 전달의 표준으로 등장했습니다6. 이들은 직경이 50-100 nm인 복잡한 나노입자로, 전하가 중화될 때 다른 지질 성분과 분리될 수 있는 양이온성 이온화 지질로 주로 구성되어 LNP 코어에 무정형 기름 방울이 형성됩니다. 최근 연구7,8. LNP의 치료 분자는 용도에 따라 다릅니다. DNA, mRNA 또는 siRNA일 수 있습니다. 경계면에 포획되거나 흡착되는 기능적 실체에는 PEG 부분(보통 지질 사슬에 연결됨), 보조 지질 및 콜레스테롤이 포함됩니다. 지질 나노입자는 이전의 지질 기반 핵산 전달 시스템에 비해 높은 핵산 캡슐화 효율성, 보다 강력한 형질감염, 향상된 조직 침투, 낮은 세포독성 및 면역원성 등 많은 이점을 제공합니다. 이러한 특성으로 인해 지질 나노입자는 코로나19에 대한 mRNA 기반 백신에서 입증된 것처럼 핵산 전달을 위한 탁월한 후보가 됩니다.

LNP는 자기 조립 과정을 통해 형성됩니다. 수치 시뮬레이션에 따르면 자기 조립 과정에는 원판형 클러스터로의 입자 조립, 더 큰 막 패치로 클러스터의 집합, 소포 형성의 세 단계가 포함됩니다. 확산에 의한 자가 조립은 너무 느리기 때문에(수일이 소요됨) 유체역학적 혼합이 필요합니다. 대형 용기에 표준 믹서5를 사용하는 것은 선택 사항입니다. 그러나 이러한 혼합기는 낮은 캡슐화 효율성과 함께 크기 다분산성을 생성합니다. 따라서 이러한 방식으로 생산된 LNP의 품질을 향상시키기 위해서는 여과, 압출 및 원심분리와 같은 후처리 단계가 필요합니다. 이러한 맥락에서 미세유체 믹서의 사용이 적합합니다. 미세유체를 사용하면 높은 수율로 단일 단계에서 단분산도 및 캡슐화 수율 측면에서 허용 가능한 품질의 LNP를 생산할 수 있다는 것이 최근 입증되었습니다. Fujishima 등10과 Shepherd 등11에서는 엇갈린 헤링본 마이크로믹서12가 사용되었습니다. 헤링본 마이크로믹서의 한 가지 한계는 낮은 처리량입니다. 이러한 제한은 시스템을 병렬화함으로써 피할 수 있습니다11. 그러나 이 옵션은 복잡성을 야기하고 비용을 증가시키며 신뢰성을 감소시킵니다. 훨씬 더 높은 유속으로 작동하여 더 높은 처리량을 제공하는 관성 마이크로 믹서가 해결책을 제공하지만 지금까지 문헌에서 일부 징후를 찾을 수 있지만 기능성 LNP를 얻기 위해 작동해야 하는 조건은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다.

4 ml/min: Highly mixed regime with homogeneity factors above 80% and flat, reproducible concentration profiles. The Reynolds number range lies between 220 and the maximum value reached in the experiment, i.e., 1100./p> 4 ml/min at 7% (see Fig. 8B). In parallel, the EE was approximately 60% below 2 ml/mn, while particles formed at higher Q, above 4 ml/min, had an EE of approximately 80% (see Fig. 8C). These results were consistent with the results of the mixing study we performed. We have plotted, on the same graph, the boundaries of the three zones we singled out in Fig. 7 i.e., the poorly mixed, transition and highly mixed regions. Notably, the characteristics of the LNP structure correlate well with the mixing characteristics of the device. In addition, the ζ potential, indicating the effective surface charge29, was also measured. Regardless of the flow rate used, all LNPs exhibited a zeta potential of ζ = − 13 mV + /− 4 mV at pH 7.4 and were thus slightly negative. The measurement was consistent with Ref25 and suggested a loss of the positive charge of the ionizable lipid./p> 4 mL/min. At high FRR, \(\varepsilon_{m}\) is close to that of water, and the LNPs have optimal properties, while at small FRR, \(\varepsilon_{m}\) is substantially smaller, the energy landscape ‘seen’ by the LNP constituents is changed, and we may hypothesize that this affects the self-assembling process and thereby LNP morphologies in a detrimental manner. This type of situation occurs when important quantities of ethanol are used in the formulation24,30,31,32. From Fig. 9C, we estimate that the crossover between the nonoptimal and optimal cases is located around an effective relative dielectric constant \(\varepsilon_{m}\) close to 60, still for Q = 4 ml/min, which corresponds to a flow-rate ratio (FRR) on the order of 2./p>

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